Il est né à Mutzig (Bas-Rhin) le 4 mars 1833, fils de Jean-Baptiste Chassepot, réviseur d'armes et d'Hélène Bruder.
En 1851, il rejoint son oncle Pierre-Auguste Chassepot, contrôleur principal à la Manufacture d'armes de Châtellerault puis arrive à Saint-Étienne en 1856.
Le 10 mai 1859, à Châtellerault (Vienne), il épouse sa cousine germaine, Pauline Augustine Chassepot née le 27 février 1840 à Mutzig, fille de Pierre-Auguste et de Françoise Wilhelmine Bonne (décédée à Châtellerault le 27 février 1858), domiciliée chez son père, alors à la retraite. Antoine Alphonse est alors contrôleur de deuxième classe à la Manufacture Impériale d'armes de Saint-Étienne.
Deux enfants naîtront à Saint-Étienne, Marie Alphonsine Hélène en 1860 et Alphonse Auguste Achille en 1862.

Il est l'inventeur du célèbre fusil à aiguille qui porte son nom, breveté le 27 août 1866, ce qui vaudra à Alphonse Chassepot la croix de Chevalier de la Légion d'honneur dès le 30 août 1866 et une indemnité de 30000 F. Capable de tirer à 1200 m, ce fusil fut immédiatement adopté par l'armée française. Commandé en 400000 exemplaires par l'Empereur pour le 1er janvier 1868, les manufactures de Saint-Étienne, Châtellerault, Mutzig et Tulle le produisent.

Avant même le décret de son brevet, Alphonse Chassepot l'avait cédé à l'entreprise Cahen-Lyon et Cie pour en devenir l'associé. Cette société demande au ministre de la Guerre de lui céder des armes déclassées afin de les transformer en Chassepot et les revendre à l'étranger. Cette demande ayant été acceptée, l'entreprise signe avec Chassepot un droit d'exploitation exclusif de son brevet.

Toutes les manufactures d'armes réunies ont du mal à honorer la commande, l'État fait appel à l'industrie privée mais l'entreprise Cahen-Lyon et Cie fait valoir son droit et devient le seul fournisseur privé. N'ayant pas la capacité industrielle suffisante, cette entreprise se tourne vers la sous-traitance étrangère. On estime à 50000 le nombre de fusils Chassepot fabriqués à l'étranger, Birmingham, Londres, Bescia, Placentia, Liège ou Vienne.

Alphonse Chassepot fut promu Officier de la Légion d'honneur le 12 mars 1870 et son fusil fut le symbole de la guerre de 1870. À Saint-Étienne, on a aussi fabriqué les baïonnettes Chassepot.

Le brevet a été contesté par Jules Manceaux directeur de la Manufacture de Tulle mais la justice a donné raison à Alphonse Chassepot. Cependant, comme il avait cédé ses droits à l'État après le décret de brevet, il entra en conflit avec le ministère de la Guerre ce qui le poussa à intenter un procès à la société Cahen-Lyon et Cie, procès qu'il perdit en 1872 le contraignant à démissionner des fonctions qui le liaient au ministère.
Antoine Alphonse Chassepot est mort Gagny (Seine-Saint-Denis) le 5 février 1905.
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